Sanger法测序原理和步骤PPT

Sanger法测序原理和步骤如下：Sanger法测序原理Sanger法测序的原理是基于DNA聚合酶链式反应（PCR）技术和DNA末端终止法。Sanger法...

Sanger法测序原理和步骤如下：Sanger法测序原理Sanger法测序的原理是基于DNA聚合酶链式反应（PCR）技术和DNA末端终止法。Sanger法测序主要使用了四个荧光染料，这四个荧光染料的颜色各不相同，分别标记着四种不同的碱基：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。在PCR扩增的过程中，每次加入一个荧光染料，该荧光染料会随机地与一个新生成的DNA单链结合，这样，每一个新生成的DNA单链都带有特定的荧光标签。由于不同的荧光标签有不同的颜色，因此通过控制凝胶电泳的波长，可以只激发那些带有特定荧光标签的DNA单链，从而将它们区分开来。通过这一过程，可以得到一系列长度不同、带有不同荧光标签的DNA片段，这些片段的长度就代表了原始DNA序列中相对应位置的碱基。Sanger法测序步骤Sanger法测序主要包括以下步骤：准备样品首先，需要将待测的DNA样品进行分离，纯化出其中的多聚核苷酸。这个步骤通常使用酚氯仿抽提法和氯仿异戊醇抽提法来去除蛋白质和其他杂质。之后，将纯化的DNA进行变性处理，将其中的双链DNA解开成为单链。合成引物在PCR扩增中，需要一段已知序列的DNA片段作为引物，来启动DNA聚合酶链式反应。在Sanger法测序中，需要合成四种不同碱基（A、G、T、C）的引物，每种引物的3'端与待测DNA序列的互补序列相连接。进行PCR扩增使用合成的引物和DNA聚合酶，将待测的DNA序列进行PCR扩增。在PCR反应中，每个循环都会合成一个新的DNA片段，这个新合成的DNA片段的长度会比前一个片段多一个碱基。加入荧光染料在PCR扩增的过程中，每个循环的最后一步是加入一种荧光染料。该染料会随机地与新合成的DNA单链结合，这样每个新合成的DNA单链都带有特定的荧光标签。这些荧光标签的颜色与该单链的碱基序列相关。凝胶电泳分离将带有荧光标签的DNA片段进行凝胶电泳分离。由于不同的DNA片段长度不同，因此在凝胶电泳中移动的速度也不同，这样就可以将不同长度的DNA片段分离开来。荧光检测和数据分析在凝胶电泳分离的过程中，使用特定的波长激发凝胶中的DNA片段，这样就可以使带有特定荧光标签的DNA片段发出荧光。通过荧光信号的强度和位置，可以判断出每个片段的长度和碱基序列。最后，将这些数据进行分析，就可以得到待测DNA序列的基因序列。序列解读解读测序结果需要对得到的片段进行比对，找出对应的碱基。由于凝胶是分开的，因此可以通过凝胶上的距离判断出片段的长度。对于每个片段，从3'端开始解读，根据距离判断出第一个碱基是A、T、G还是C。按照这样的方式解读完所有片段后，就可以得到整个基因的碱基序列。以上是Sanger法测序原理和步骤的简要介绍。值得注意的是，现代的测序技术已经发展得相当成熟，有许多自动化、高通量的方法可以用于DNA测序。Sanger法虽然经典但费时费力，现在主要被用于小片段DNA的测序和一些需要验证的特殊情况。